MEDIOS DE CULTIVO

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).1- disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de los factores nutritivos lábiles.
Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.
Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
2- consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.
3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
4- condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.
5- Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.
6- pH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.
7- Temperatura
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.
8- Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

TINCION DE BACTERIAS

Técnicas de tinción. Fundamentos
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estruturales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósítos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.

INTRUMENTOS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

-cabinas de seguridad para realizar la muestra de siembra.

-estufas de cultivo que permiten incubar los cultivos a diferentes temperaturas.

-neveras para guardar los reactivos.

-congeladores opticos y de fluorescencia.

-microcopios-se utiliza para la esterilizacion de los medios de cultivo, algunos materiales y los cultivos potencialmente peligrosos

-agitadores calefactor para preparar los medios.

-balanza para pesar los medios que vienen deshidratados (en polvitos)

matraz aforado se usa para preparar soluciones concentradas conocida y exacta

-termometro sirve para medir temperaturas

MEDIDAS DE SEGURIDAD DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Las siguientes medidas son de obligado cumplimiento en cualquier área del laboratorio:
El acceso al laboratorio estará limitado al personalautorizado.
No deben entrar en el mismo familiares ni amigos.
El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas de
seguridad.
Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo biológico y su nivel de contención.
Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada contención biológica.
Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente y siempre que se produzca un derrame. Los residuos y muestras peligrosas que van a ser incinerados fuera del laboratorio deben ser transportados en contenedores cerrados, resistentes e impermeables siguiendo las normas específicas para cada tipo de residuo.
El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado y no es aconsejable utilizar los pasillos como almacén. Siempre debe quedar un espacio libre no inferior a
120 cm para poder evacuar el laboratorio en caso de emergencia.
El transportede las muestras dentro o entre laboratorios se realizará de tal manera que, en caso de caída, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas herméticas o neveras transportables. Estas cajas o neveras deberán ser rígidas y resistentes a los golpes, contar con materiales absorbentes en su interior y de fácil desinfección. Se etiquetarán o identificarán de forma oportuna y no podrán ser utilizadas para otros fines. Bajo ningún conceptose deben transportar las muestras a mano.
La ropa protectora, fácilmente ajustable y confortable, así como guantes, gafas, etc. debe estar disponible en todo momento. La ropa protectora de las áreas con nivel de contención 3 (batas) nunca debe ser usada fuera del área de trabajo y si se quita debe de ser desechada automáticamente en una bolsa de material contaminado. Jamás debe volver a ser usada.
Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se manipulen muestras o cultivos que contengan posibles patógenos. Los guantes siempre serán desechados antes de salir del área de trabajo. Jamás se saldrá de la misma con los guantes puestos, ni con ellos se cogerá el teléfono, se tocarán las hojas de examen, maniguetas de las puertas, etc.
Tras quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos.
Se usarán gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o aerosoles.
Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de autoinoculación y de generación de aerosoles.
Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al Supervisor y al Jefe del Laboratorio y hacerse constar por escrito.
Nadie podrá trabajar en el área de tuberculosis con una prueba de Tuberculina negativa.
Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizará pipeteo automático con material adecuado y cada trabajador será instruido para manejarlo debidamente.
En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el papel contaminado es de muy difícil esterilización.
No deberán usarse lentes de contacto.
El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido.
Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos esta formalmente prohibido en el área de trabajo del laboratorio, así como el almacenamiento de comida o bebida.
El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias, tras acabar la jornada laboral y siempre antes de abandonar el laboratorio (almorzar). Se usará un jabón antiséptico y el secado se realizará con papel.
Las heridas y cortes en las manos, si se han producido en el Laboratorio, serán comunicados al responsable de la Sección correspondiente, así como al Supervisor de Bioseguridad que lo registrará haciendo constar todas las circunstancias. Las heridas y cortes deben ser convenientemente vendados y después es imprescindible ponerse guantes

BACTERIAS

Las bacterias son microorganismos unicelulares que presentan un tamaño de algunos micrómetros de largo (entre 0,5 y 5 μm, por lo general) y diversas formas incluyendo esferas, barras y hélices. Las bacterias son procariotas y, por lo tanto, a diferencia de las células eucariotas (de animales, plantas, etc), no tienen núcleo ni orgánulos internos. Generalmente poseen una pared celular compuesta de peptidoglicano. Muchas bacterias disponen de flagelos o de otros sistemas de desplazamiento y son móviles. Del estudio de las bacterias se encarga la bacteriología, una rama de la microbiología.
Las bacterias son los organismos más abundantes del planeta. Son ubicuas, encontrándose en todo hábitat de la tierra, creciendo en el suelo, en manantiales calientes y ácidos, en desechos radioactivos, en las profundidades del mar y de la corteza terrestre. Algunas bacterias pueden incluso sobrevivir en las condiciones extremas del espacio exterior. Se estima que hay en torno a 40 millones de células bacterianas en un gramo de tierra y un millón de células bacterianas en un mililitro de agua dulce. En total, se calcula que hay aproximadamente 5×1030 bacterias en el mundo
Las bacterias son imprescindibles para el reciclaje de los elementos, pues muchos pasos importantes de los ciclos biogeoquímicos dependen de éstas. Como ejemplo cabe citar la fijación del nitrógeno atmosférico. Sin embargo, solamente la mitad de los filos conocidos de bacterias tienen especies que se pueden cultivar en el laboratorio,[3] por lo que una gran parte (se supone que cerca del 90%) de las especies de bacterias existentes todavía no ha sido descrita.
En el cuerpo humano hay aproximadamente diez veces tantas células bacterianas como células humanas, con una gran cantidad de bacterias en la piel y en el tracto digestivo. Aunque el efecto protector del sistema inmune hace que la gran mayoría de estas bacterias sea inofensiva o beneficiosa, algunas bacterias patógenas pueden causar enfermedades infecciosas, incluyendo cólera, sífilis, lepra, tifus, difteria, escarlatina, etc. Las enfermedades bacterianas mortales más comunes son las infecciones respiratorias, con una mortalidad sólo para la tuberculosis de cerca de dos millones de personas al año.En todo el mundo se utilizan antibióticos para tratar las infecciones bacterianas. Los antibióticos son efectivos contra las bacterias ya que inhiben la formación de la pared celular o detienen otros procesos de su ciclo de vida. También se usan extensamente en la agricultura y la ganadería en ausencia de enfermedad, lo que ocasiona que se esté generalizando la resistencia de las bacterias a los antibióticos. En la industria, las bacterias son importantes en procesos tales como el tratamiento de aguas residuales, en la producción de queso, yogur, mantequilla, vinagre, etc, y en la fabricación de medicamentos y de otros productos químicos.
Aunque el término bacteria incluía tradicionalmente a todos los procariotas, actualmente la taxonomía y la nomenclatura científica los divide en dos grupos. Estos dominios evolutivos se denominan Bacteria y Archaea (arqueas). La división se justifica en las grandes diferencias que presentan ambos grupos a nivel bioquímico y en aspectos estructurales.
Las bacterias malentendidas
Las bacterias están asociadas con la suciedad, la enfermedad y la muerte.
Las bacterias sufren de un caso de relaciones públicas negativas. Usted probablemente asocia a las bacterias con las palabras suciedad, enfermedad y muerte. Y de hecho, por siglos, las infecciones bacterianas fueron la mayor causa de la mortalidad infantil en el mundo. La mortalidad infantil comenzó a disminuir cuando la gente aprendió a tener una mejor higiene. La disminución continuó con la introducción de los antibióticos para el mejor tratamiento y con la vacunación para la prevención de las enfermedades mortales más comunes.
Las bacterias, de hecho, sí están involucradas con la suciedad, la enfermedad y la muerte, a las cuales deberíamos añadir la descomposición. La descomposición de las sobras de la comida, de los desechos del jardín, de los cuerpos muertos y las aguas malolientes de una vasija olvidada son todos el resultado de la actividad de las bacterias. También lo son el olor corporal, las caries, la inflamación de la garganta y la peste bubónica, para solo nombrar algunas de las enfermedades a ambos extremos del espectro. Con razón las bacterias reciben tanta prensa negativa.
Las bacterias que causaron las grandes enfermedades de nuestra historia pueden estar cerca de la extinción.
Los comerciales de la televisión quieren que nosotros pensemos que la única bacteria buena es una bacteria muerta. Hoy en día se añaden agentes antibacteriales a la pasta de dientes, al jabón, a los detergentes y a los plásticos. No existe una Sociedad para la Protección de las Bacterias, aunque existe una iniciativa satírica para el Tratamiento Ético de las Bacterias.1 Algunas bacterias pueden estar muy cerca de la extinción y no es coincidencia que estas bacterias son patogénicas (que causan enfermedades), tales como la Salmonella typhi (la causa de la fiebre tifoidea) o Yernisia pestis (la causa de la plaga). Afortunadamente para las pequeñas criaturas, algunas poblaciones de ellas sobreviven en áreas remotas, donde no han sido eficientemente cazadas y perseguidas con vacunas o con agentes antimicrobianos. En estos lugares, la gente aún corre el riesgo de contraer las enfermedades que ellas causan.
El reino bacteriano
Es tiempo de darle un vistazo más cercano al Reino de las Bacterias, así, en mayúsculas. Porque de verdad que es un Reino, hablando biológicamente, y tanto el linaje antiguo, como la diversidad y el poder evolucionario de los habitantes de este reino merecen recibir un tratamiento real, en vez de desprecio.
Antes de despertar la fascinación por el mundo de las bacterias, debemos aclarar un concepto equivocado: las bacterias no son virus.
Mientras la mayoría de las bacterias viven como células independientes con una membrana que las separa del mundo exterior, los virus solo pueden multiplicarse dentro, y en detrimento, de las células que ellos infectan. Interesantemente, algunos virus llamados bacteriófagos, se ha especializado en infectar a bacterias.2,3
Una bacteria es diferente a un virus en su estructura y en la manera en que habita a su huésped.
Los virus están compuestos de material genético (ADN o ARN) rodeado de una cáscara de proteína. Ellos no pueden metabolizar y, una vez dentro de una célula huésped, su material genético secuestra a la maquinaria de la célula para producir réplicas de sí mismo.
Las bacterias son mucho más similares a usted y a mi. Ellas exhiben las características básicas de todos los seres vivientes: ellas respiran, metabolizan, producen desechos y mantienen un potencial de membrana. Sin embargo. Ellas no poseen un núcleo en el cual el ADN se encuentra separado del resto de la célula, como se ve en las plantas y en los animales. Esta es la distinción mayor entre los procariotes (el tipo de célula que compone a la mayoría de los microorganismos, incluyendo a las bacterias) y los eucariotes (un tipo diferente de célula que forma a la mayoría de los microorganismos nucleados, como la levadura, o a las células de los organismos, por ejemplo, de los humanos).
Tanto los virus como las bacterias pueden causar enfermedades. Sin embargo, no todos los tipos de virus causan enfermedades en los humanos y no todas las bacterias causan enfermedades.
La mayoría de las bacterias son inofensivas y algunas son beneficiosas.
Otro error de concepto que tenemos es que las bacterias son malas para la gente. Es cierto que uno no quiere encontrarse con algunas bacterias, pero la mayoría de ellas son completamente inofensivas y algunas hasta son altamente beneficiosas para la gente. Algunas bacterias pueden ser beneficiales para algunos animales y patogénicas para otros, lo cual crea confusión. Sin embargo, lo más común es que las bacterias patogénicas causen problemas a un número limitado de huéspedes (o a un solo huésped) mientras que pueden sobrevivir alegremente en otros huéspedes sin causarles problemas. Si el sufriente huésped resulta ser humano, la bacteria culpable es llamada un patógeno humano. Sin embargo, desde el punto de vista de las bacterias, los humanos son exactamente el tipo de huésped a evitar. Por eso, ¿Cómo podemos echarles la culpa de causar enfermedades?
La mayoría de las bacterias son completamente inofensivas
Las bacterias inofensivas pueden hacerse letales bajo ciertas circunstancias.
A pesar de que un árbol al caer puede matar a una persona, generalmente no consideramos a los árboles como dañinos. Lo mismo es cierto para la mayoría de las bacterias. A pesar de que ellas pueden causar problemas bajo ciertas condiciones específicas, generalmente ellas viven sus vidas sin interferir con las nuestras. Un ejemplo es la Pseudomonas aeruginosa, la cual vive comúnmente en el suelo sin causar daño a nadie. Sin embargo, si esta bacteria es inhalada por una persona que tiene Fibrosis Cística, ella puede colonizar sus pulmones y causar infecciones letales.4
Para muchas bacterias, el cuerpo humano no es el lugar adecuado para vivir.
Ellas no pueden soportar la falta de oxígeno (la concentración de oxígeno dentro de nuestras células es menor que la concentración en el ambiente) o la presencia de oxígeno (el cual es tóxico para las bacterias que viven en ambientes que no poseen o que tienen muy poco oxígeno).
El cuerpo humano no es el ambiente natural para muchas bacterias.
Ellas no pueden aguantar nuestros mecanismos de defensa, tales como la sal que está presente en nuestra piel y en nuestras lágrimas, la falta de hierro (un mecanismo muy ingenioso en nuestro cuerpo mantiene el hierro, un elemento vital para todos los organismos vivos, inaccesible a la mayoría de los microorganismos en nuestro cuerpo), o los radicales tóxicos que las células liberan cuando se ven atacadas por las bacterias.
Puede ser demasiado cálido para ellas o demasiado frío, ya que ciertas bacterias poseen requerimientos específicos de temperatura para crecer.
pueden ser privadas de alimento, ya que los miembros del Reino Bacteriano en general se han especializado en vivir de prácticamente cualquier cosa, pero cada especie posee necesidades específicas de nutrientes.
En conclusión, no tenemos nada que temer de la mayoría de las bacterias que encontramos.
Nuestros cuerpos pueden resistir a la mayoría de los ataques de bacterias.
No es una gran sorpresa que somos relativamente inertes a las bacterias. Después de todo, los mamíferos evolucionaron en presencia de las bacterias y han desarrollado estrategias especializadas para mantener a las bacterias bajo control. A pesar de lo que su madre puede haberle enseñado cuando pequeño, el jabón no es esencial para sobrevivir. Nuestro cuerpo puede resistir muy eficientemente el bombardeo de bacterias que recibe todos los días. Menos mal que no podemos ver esto, pues la idea no es placentera, pero con cada bocanada de aire y con cada mordisco que tomamos, estas pequeñas criaturas entran constantemente a nuestro cuerpo. Pero esto no debe preocuparle en lo absoluto, siempre y cuando usted pueda mantener a los alborotadores (los verdaderos patógenos) fuera.